番茄紅素(Lycopene)是一種抗氧化活性很強(qiáng)的萜類物質(zhì)，具有猝滅單線態(tài)氧、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等多種生理功能活性，在癌癥預(yù)防，抗衰老，保護(hù)心腦血管和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面有廣泛應(yīng)用，被世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)認(rèn)定為A類營養(yǎng)素，市場前景較好。

　　目前生產(chǎn)番茄紅素常用的方法有直接提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。由于原料番茄的供應(yīng)受到氣候與季節(jié)的影響，使得直接提取法生產(chǎn)成本較高。化學(xué)合成法一般以β-紫羅酮為原料，合成過程步驟繁瑣，且化學(xué)試劑殘留問題限制了產(chǎn)品的使用范圍。而微生物發(fā)酵法由于不受氣候和季節(jié)影響、生產(chǎn)周期短、易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢逐漸受到人們的關(guān)注。因此，在此分享一種使用大腸桿菌作為發(fā)酵菌株生產(chǎn)番茄紅素的實(shí)驗(yàn)流程。

構(gòu)建表達(dá)載體和大腸桿菌工程菌

篩選大腸桿菌工程菌

大腸桿菌工程菌的發(fā)酵

　　3.1將篩選得到的單克隆陽性菌株接種于不同配方培養(yǎng)基中，按照培養(yǎng)基種類進(jìn)行分組;

　　3.2于搖床中，對多組樣品進(jìn)行恒溫培養(yǎng)72小時(shí);

　　3.3發(fā)酵過程中每間隔兩小時(shí)需對培養(yǎng)基進(jìn)行取樣檢測(單個(gè)樣品取樣與檢測時(shí)間約10min，需對培養(yǎng)基及時(shí)補(bǔ)液并注意無菌操作);

　　3.4連續(xù)記錄72小時(shí)發(fā)酵期間多組大腸桿菌培養(yǎng)基的濃度數(shù)據(jù)并以此繪制生長曲線。

番茄紅素的提取與測定

　　本實(shí)驗(yàn)的周期較長，實(shí)驗(yàn)過程中需頻繁對培養(yǎng)基進(jìn)行取樣分析，耗時(shí)耗力的同時(shí)易造成培養(yǎng)缺液和污染，對實(shí)驗(yàn)人員的精力和時(shí)間安排要求較高。為解決以上多類問題，特別推出寧波新芝這一款微生物生長曲線儀MGC-200，憑借這臺儀器的技術(shù)特點(diǎn)可完美適配發(fā)酵生產(chǎn)需求，傳統(tǒng)培養(yǎng)方式存在的各類問題也得到完美解決。

01高通量培養(yǎng)

能夠同時(shí)最多192個(gè)樣品進(jìn)行檢測(2個(gè)孔板適配器)

多種孔板選擇24、48、96孔板

培養(yǎng)體積0.2-2mL

有光照模式，可以培養(yǎng)藻類

02數(shù)據(jù)精準(zhǔn)多樣

全波段檢測300-850nm

可以調(diào)取區(qū)間任意波段數(shù)據(jù)

兩種檢測模式-全波段掃描模式和吸光度檢測模式

03數(shù)據(jù)自動(dòng)處理

自動(dòng)識別孔板

預(yù)設(shè)程序可以中途變溫

04氣體控制

二氧化碳檢測器

氧氣檢測器

能夠滿足專性厭氧和好氧菌體培養(yǎng)

使用流程

01配微生物培養(yǎng)基

按照培養(yǎng)基配方，使用天平稱取一定量的培養(yǎng)基成分，加一定量的純水，配成培養(yǎng)基后，放入高壓滅菌鍋滅菌。

02接菌活化

在超凈工作臺，從固體培養(yǎng)基表面接菌到液體培養(yǎng)基，然后搖床培養(yǎng)一段時(shí)間。

03分液

在超凈工作臺，用移液器將菌液和無菌培養(yǎng)基加到微孔板，注意避免手接觸蓋子和底部，防止后續(xù)上微生物生長曲線分析儀時(shí)影響光路。

04上機(jī)

小心將加好液的培養(yǎng)板放置到微生物生長曲線分析儀，注意避免震蕩，防止液滴濺到微孔板蓋子上。然后蓋上微孔板適配器熱蓋，之后合上微生物生長曲線分析儀蓋子。

05設(shè)置培養(yǎng)程序

在軟件內(nèi)設(shè)置培養(yǎng)程序，包括培養(yǎng)程序名稱、溫度、培養(yǎng)時(shí)間、檢測波長、轉(zhuǎn)速、統(tǒng)一對照/分組對照等;以大腸桿菌為例，培養(yǎng)溫度設(shè)置為36℃，以1%(v:v)進(jìn)行接種，培養(yǎng)體積為200 μL(96孔板)，檢測波長設(shè)置為600 nm，轉(zhuǎn)速預(yù)搖勻速度設(shè)置為1100 rpm/min，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速設(shè)為800 rpm/min，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為72 h(常規(guī)設(shè)為24 h)，采樣時(shí)間為2 h/次(最小可設(shè)置為5 min/次)。

06設(shè)置孔位設(shè)計(jì)

按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對微孔板上參考樣本、培養(yǎng)樣本等進(jìn)行設(shè)置和命名，選擇是否開光程標(biāo)準(zhǔn)化。

07開機(jī)運(yùn)行

08結(jié)束實(shí)驗(yàn)

運(yùn)行24h后停止培養(yǎng)并獲取數(shù)據(jù)，關(guān)機(jī)結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

應(yīng)用案例

應(yīng)用領(lǐng)域

測量不同因子對微生物的的復(fù)合效應(yīng)，如pH、溫度、水分活度、鹽度、化學(xué)品等

生物法測量維生素、氨基酸、抗生素、消毒劑、毒素、生物刺激素、生長阻滯劑的含量

連續(xù)報(bào)告多個(gè)培養(yǎng)物中生長參數(shù)

污染物生物降解條件的優(yōu)化

研究噬菌體生長動(dòng)力學(xué)曲線

酵母菌等菌種的研究

研發(fā)新的抗菌劑

微生物單細(xì)胞蛋白SCP生產(chǎn)工藝的提高(發(fā)酵條件優(yōu)化)

研究酸奶、酒類、食品等生產(chǎn)工藝

酶、蛋白、脂肪酸或其他物質(zhì)的生產(chǎn)(發(fā)酵工業(yè)優(yōu)化)

污水處理、生物膜和活性污泥處理工藝的提高

確定抗菌劑的最小抑制濃度

確定抗生素或其他化合物最小致死劑量

測定不同物質(zhì)的毒性和潛在誘變性

內(nèi)毒素的LAL測試

制作微生物、噬菌體、細(xì)胞生長的數(shù)學(xué)模型

研發(fā)特征性微生物

研發(fā)微生物和細(xì)胞的選擇性和非選擇性培養(yǎng)基

細(xì)菌尿的檢測

微生物防腐劑的鑒定(耐藥性鑒定類似)